RNA交联是通过物理或化学手段在RNA与RNA结合蛋白（RBP）之间形成稳定共价键的技术，用于研究RNA-蛋白质相互作用。UV紫外交联是目前最主流的方法：利用路阳UCL-3200/3500交联仪254 nm短波紫外光照射活细胞，当RNA碱基（主要是尿嘧啶）与蛋白质氨基酸残基距离足够近时，紫外光激发碱基π电子，使其与蛋白质侧链形成共价键。这种"零长度交联"无需化学试剂介入，仅捕获直接接触的分子对，背景低、定位精确，是CLIP（交联免疫沉淀）技术的核心基础。CLIP技术已发展出HITS-CLIP、iCLIP（单核苷酸分辨率）、PAR-CLIP（光活化核苷增强，需365 nm）、eCLIP等多个衍生版本，广泛应用于转录后调控网络研究。
1. 样品准备：培养细胞至汇合度80%-90%，预冷PBS洗涤2次，吸尽PBS。
2. UV交联（核心步骤）：打开培养皿盖，置于路阳UCL-3200/3500交联仪腔体中央，254 nm波长、能量模式设置150 mJ/cm²（0.150 J/cm²），关闭舱门启动。路阳UCL-3200/3500交联仪仪器实时监测辐照能量，达标后自动停止并蜂鸣提醒。取出后立即冰上操作，刮取细胞，4°C离心收集沉淀。
3. 细胞裂解与RNA片段化：预冷裂解液（含蛋白酶/ RNase抑制剂）冰上裂解30 min，离心取上清。加入RNase I 37°C孵育5-10 min，将RNA切割为30-60 nt片段。
4. 免疫沉淀：加入目标蛋白特异性抗体4°C孵育2-4 h，再加Protein A/G磁珠孵育1-2 h。高盐洗涤液洗3次，常规洗涤液洗2次。
5. 接头连接与标记：去磷酸化后用T4 RNA连接酶连接3'端接头，再用T4 PNK和[γ-³²P]ATP进行5'端放射性标记。
6. SDS-PAGE与转膜：样品上样10% Bis-Tris凝胶电泳，湿转至NC膜。放射自显影定位RBP-RNA复合物条带，切下对应膜区。
7. RNA回收与测序：Proteinase K消化膜上蛋白质，酚-氯仿抽提回收RNA。逆转录合成cDNA，PCR扩增（含barcode），切胶纯化150-300 bp片段，Illumina平台高通量测序。
路阳UCL-3200/3500交联仪两款均为微处理器控制的254 nm紫外辐照系统，适用于核酸膜交联、RNA-蛋白质交联、PCR污染消除等场景，同时提供302 nm（M型）和365 nm（L型）可选。
1. 微处理器闭环控制：实时监测紫外强度，达到预设能量自动停止，灯管老化也不影响交联剂量一致性，结果可重现。
2. 光强高度均匀：镜面发射板 + 橘面反射板组合，腔体内任意位置辐照强度一致。
3. 传感器防护：紫外传感器配石英玻璃防护罩，隔绝化学试剂污染，检测精度长期稳定，维护成本低。
4. 极速启动：无需预热，样品处理流程紧凑。
5. 操作便捷：9组预设能量值，开机记忆上次设置，一键调用；交联完成蜂鸣提醒并自动待机，无需值守。
6. 参数应用广泛：能量0.000-99.99 J/cm²、时间0-599.5 min，覆盖CLIP、膜交联、紫外灭活等多种场景。
7. 安全可靠：全封闭腔体屏蔽紫外辐射，打开自动停止；三年保修。
1. 紫外安全：254 nm紫外可损伤皮肤和眼睛，操作时确保舱门关闭，严禁辐照中开门。
2. RNase防控：全程无RNase操作，耗材需无RNase级，操作台用RNase Zap清洁，佩戴无粉手套并勤换，样品始终保持冰上。
3. 交联能量优化：不同细胞和蛋白最佳剂量不同，建议50-400 mJ/cm²梯度预实验，能量过低信号弱、过高导致RNA降解。
4. 对照设置：必须设未交联对照（No CL）、IgG同型对照、Input对照，排除假阳性。
5. 样品保存：交联后细胞沉淀-80°C可存1-2个月，避免反复冻融；放射性样品按规范处理。
6. 设备维护：定期清洁腔体和灯管，石英罩用乙醇轻擦，灯管约2000小时寿命需及时更换，每年校验辐照精度。
