技术文章您现在的位置:首页 > 技术文章 > GFP的发光原理

GFP的发光原理

更新时间:2024-02-21   点击次数:222次

在我们选择荧光蛋白时,首要考虑的是荧光蛋白的聚合性质,即是否会影响目的蛋白的功能及定位,其次是荧光蛋白的 PK 值是否与目的蛋白所处的环境的 pH 值相匹配,然后是荧光蛋白的成熟时间以及目的蛋白的寿命,综合两者决定荧光蛋白是否合适,zui后考虑荧光蛋白的光稳定性、密码子偏好性是否合适,zui后考虑目的蛋白放的位置,荧光蛋白是否会影响目的蛋白的功能及定位。

发光原理:
GFP的第65至67位的三个氨基酸(丝氨酸-酪氨酸-甘氨酸)残基,可自发地形成一种荧光发色团。当蛋白质链折叠时,这段被深埋在蛋白质内部的氨基酸片段,得以“亲密接触",导致经环化形成咪唑酮,并发生脱水反应。在分子氧存在的条件下,发色团可进一步发生氧化脱氢,zui终成熟,形成可发射荧光的形式。具体过程为:在 O2存在下,GFP分子内第67位甘氨酸的酰胺对第65位丝氨酸的羧基进行亲核攻击,形成第5位碳原子咪唑基;第66位酪氨酸的α2β键脱氢反应之后,导致芳香团与咪唑基结合,并zui终自发催化形成对羟基苯甲酸咪唑环酮生色。

GFP需要在氧化状态下产生荧光,强还原剂能使GFP转变为非荧光形式,但一旦重新暴露在空气或氧气中,GFP荧光便立即得到恢复。一般来说弱还原剂并不会影响GFP荧光,中度氧化剂如生物材料的固定,脱水剂戊二酸或甲醛等对GFP荧光影响也不大。

发光特性:
GFP吸收的光谱zui大峰值为395nm(紫外),并有一个峰值为470nm的副吸收峰(蓝光);发射光谱zui大峰值为509nm(绿光),并带有峰值为540nm的侧峰(Shouder)。虽然450~490nm只是GFP的副吸收峰,但由于该激发光对细胞的伤害更小,因此通常多使用该波段光源(多为488nm)。此外,GFP的光谱特性与荧光素异硫氰酸盐(FITC)很相似,两者通常共有一套滤光片。GFP荧光极其稳定,在激发光照射下,GFP抗光漂白(Photobleaching)能力比荧光素强,特别是在450~490nm蓝光波长下更稳定。类似的,GFP融合蛋白的荧光灵敏度远比荧光素标记的荧光抗体高,抗光漂白能力强,因此更适用于定量测定与分析。由于GFP荧光的产生不需要任何外源反应底物,因此GFP作为一种广泛应用的活体报告蛋白,其作用是任何其它酶类报告蛋白的。但因为GFP不是酶,荧光信号没有酶学放大效果,因此GFP灵敏度可能低于某些酶类报告蛋白,比如萤火虫荧光素酶等

上海路阳仪器有限公司

上海路阳仪器有限公司

地址:上海市松江区新桥镇泗砖南路255弄120号

主营产品:黑光灯,探伤灯,紫外线探伤灯,LED磁粉探伤灯,荧光检漏灯,荧光检漏剂,检漏手电筒,脱脂检测灯

© 2024 版权所有:上海路阳仪器有限公司  备案号:沪ICP备10002130号-7  总访问量:218593  站点地图  技术支持:化工仪器网  管理登陆