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PMA 465nm光解光源用于活细菌的筛选

发布时间:2023-01-09   点击次数:61次

  弧菌(vibrio)是水产品中为常见的致病菌,副溶血性弧菌(vibrioparahaemolyticus)是我国主要水产源致病菌,由该菌引起的食物中毒事件居细菌性食物中毒事件,同时也被视为范围内导致腹泻类疾病的为主要因素之一。霍乱弧菌(vibrio cholerae)是导致人体产生霍乱疾病的主要源头,流行广泛且属于烈性传染病之一,曾多次引起大面积的疾病,主要表现为剧烈的呕吐、腹泻、失水,严重的可导致死亡,如何快速、精准和高效地检测水产品中致病弧菌具有重要意义。

传统定量检测食品中副溶血性弧菌和霍乱弧菌的方法通常需要1周时间,基于dna的 qpcr定量技术虽简便快捷,但无法区分样品中死菌和活菌,容易导致假阳性现象。光敏型核酸染料叠氮溴化丙锭(pma)与qpcr技术相结合,可以选择性地识别水产品中的活菌dna,可用于进行活菌定量检测。pma前处理包括暗处理和光交联两个关键步骤,传统的 pma前处理方法通常在一个密闭的环境进行暗处理,手持600w左右的钠钨灯进行光交联,过程繁琐,全程人工操作费时耗力;基于蓝光led管的光交联仪器LUYOR-3419PMA光解仪可大大简化pma前处理过程。

实时荧光定量PCR 即qPCR 技术作为特定核酸片段走量的金标准,是目前应用为广泛和有效的核酸分子走量手段。考虑到细菌数量和其含有的特定核酸分子(如16S rDNA)里正比例关系,因此qPCR 技术也被用于细菌定量检测领域中o 然而在实际的微生物生态体系中,有活细菌也存在着死细菌;死细菌虽然己经死亡,但其DNA 会在较长时间内存在,因此采用qPCR 定量反映的是某种菌总菌的结果。对于微生物体系的解析尤其涉及生态功能的分析, ~t 细菌的数目更加能反映该种菌在生态体系中发挥的实际影响和作用,因此如何排除死细菌的干扰准确定量活细菌变得十分重要,由此催生了PMA-qPCR 等活细菌的定量分析技术。

叠氮澳化丙链(Propidium Monoazide , PMA) 是一种对核酸具有高度亲和力的光敏染料,由于不能透过完整的细胞膜, PMA 只能修饰细菌死亡后暴露出来的DNA 分子。用合适浓度的PMA 处理的细菌样品暴露于强光下时, PMA 所带的光敏性叠氨基团转化为高洁性的氮宾自由基,并与结合位点附近的任意碳氢化合物反应形成稳定的共价氮碳键。这样使得死细菌的DNA 获得修饰,导致其DNA 分子的qPCR 扩增被阻断;而活细菌则不受影响。相关研究表明, PMA 与qPCR 技术结合后可有效的抑制死细菌DNA 的扩增,因此PMA-qPCR 技术是一种能有效用于细菌活细胞定量检测的分子手段,现在被广泛应用于致病菌或有害菌活菌的定量检测等领域中。

PMA 对死细菌DNA 的共价结合效率受到多种因素的影响,主要因素有细菌种类、菌液浓度、PMA 浓度和曝光时间等。PMA 浓度和曝光时间的选择在于:PMA 浓度过低或曝光时间过短则不能充分结合和修饰死细菌的DNA; 而PMA 浓度高到一定程度则会有不容忽视数量的PMA 分子渗透进活细菌细胞内,长的曝光时间将增强其对活菌DNA 的结合和修饰作用。因此采用PMA-qPCR 对某一研究体系中特定活细菌进行走量检测时,往往先在固定的纯菌浓度下探究佳的PMA 处理浓度和曝光时间,之后用于实际从而达到更高的准确率。

PMA -qPCR ~t菌检测方法的建立与应用

(1)制备细菌悬液:培养好纯菌后,适当稀释到一定浓度(如OD600=1,即经过稀释使得在600nm 下的吸光值为1),取若干份等体积的菌,其中一半采用加热和超声处理结合制备死菌样品,而另外一半不做处理为活菌样品; 

(2) PMA 处理:在不同的PMA 浓度和曝光时间下处理(1)中的活菌组和死菌组样品; 

(3) qPCR 扩增和数据分析:提取(2) 中经PMA 处理的样品的基因组DNA ,以此为模板采用该细菌特异性的qPCR 引物进行扩增,得到各组的Ct 值(qPCR 荧光阔值同扩增曲线交点对应的循环数)综合分析选出佳的PMA 处理条件。低的PMA 浓度和曝光时间为死细菌组Ct 值稳定时(即不随PMA 浓度和曝光时间的增加而发生显著的增高,如Ct 值增量不超过1)的处理浓度和时间,高的PMA 浓度和曝光时间为活细菌Ct 稳定时的处理浓度和时间;而佳的PMA 处理条件则在高和低的PMA 浓度和曝光时间之间的实际处理条件中择优选定,这样在保证充分抑制死细菌DNA 扩增的同时又不会影响到活细菌DNA 的扩增。

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